В процеса на провеждане на генетични изследвания често срещаме недостатъчно РНК проби, например за изследване на малки анатомични орални тумори, дори едноклетъчни проби и проби от специфични генни мутации, които се транскрибират на много ниски нива в човешки клетки.Разбира се, за теста за COVID-19, ако тампоните не са на правилното място или не са достатъчно пъти по време на вземането на проби, размерът на пробата ще бъде много малък, поради което Комисията по здравеопазване и семейно планиране излезе преди два дни и е преминал теста и ако апаратът за вземане на проби от нуклеинова киселина не е взел шест проби, можете да докладвате.
Чувствителността на реагента е важна, защото имаме този или онзи проблем, така че какво можем да направим, за да подобрим чувствителността на RT-PCR?
Преди да обсъдим възможните решения, нека споменем две големи усложнения със ситуацията, която току-що споменахме.
На първо място, ние се тревожим за загубата на РНК, когато имаме само няколко клетъчни популации в нашата проба.Ако се използват традиционни методи за разделяне и почистване, като метод на колона или метод на утаяване на нуклеинова киселина, има голяма вероятност малкото проби да бъдат загубени.Едно решение е да добавите молекула носител, като tRNA, но дори и тогава няма гаранция, че нашият експеримент за възстановяване е ОК.
И така, какъв е по-добрият начин?Добър вариант за култивирани клетки или микроанатомични проби е използването на директен лизис.
Идеята е да се разделят клетките за 5 минути, да се освободи РНК в разтвора, след това да се спре реакцията за 2 минути, след това да се добави лизатът директно към реакцията на обратна транскрипция, така че да не се загуби РНК, и накрая директно да се постави получената сДНК в реакцията в реално време.
Но какво ще стане, ако поради ограничена начална точка или малко количество експресия на целевия ген можем да рециклираме цялата РНК и все още да не предоставим достатъчно шаблони, за да получим добър сигнал в реално време?
В този случай стъпката на предварително усилване може да бъде много полезна.
Следва схема за повишаване на чувствителността след обратна транскрипция.Преди да започнем, трябва да попитаме надолу по веригата кои цели ни интересуват, така че да проектираме специфични праймери за тези цели за предварително усилване.
Това може да се постигне чрез създаване на смесен праймер с до 100 двойки праймери и реакционен цикъл от 10 до 14 пъти.Следователно е необходим Master Mix, специално проектиран за това изискване, за предварително амплифициране на получената сДНК.
Причината за определяне на броя на циклите между 10 и 14 е, че този ограничен брой цикли осигурява произволност между различните цели, което е от решаващо значение за изследователите, които се нуждаят от количествена молекулярна информация.
След предварителното усилване можем да получим голямо количество cDNA, така че чувствителността на откриване в задния край да бъде значително подобрена и дори можем да разредим пробата и да извършим множество PCR реакции в реално време, за да елиминираме възможните случайни грешки.
Време на публикуване: 11 април 2023 г